Autor o autores

Esteban Rubio Romero, Miguel Galindo Campos, Diana Gómez Martín

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cybereste@hotmail.com

Centro

Sección Reumatologia Hospital Universitario Virgen del Rocio / INNSZ

Publicacion

Objetivos

La conjugación de ubicuitina, una proteína de 76 aa altamente conservada, a
un sustrato protéico, corresponde a un mecanismo de modificación
postraduccional de alta especificidad, el cual puede ser dependiente e
independiente de proteólisis. Este sistema de ubicuitinación se encarga de
regular una gran diversidad de procesos celulares, tales como diferenciación
y desarrollo, regulación del ciclo celular, reparación del DNA, modulación de
la expresión de receptores de superficie y canales iónicos, regulación de
transcripción y respuesta inmune.El sistema de ubicuitinación es capaz de
regular la respuesta inmune, al modular el equilibrio entre la activación y el
desarrollo de tolerancia, específicamente, anergia. En este caso, las ligasas
de ubicuitina (E3) constituyen los principales elementos de regulación. La
anergia es un fenómeno que se ha documentado in vivo e in vitro y se han
caracterizado dos tipos básicos de anergia en células T: anergia clonal, en la
cual se centrará este trabajo, y tolerancia adaptativa o anergia in vivo, cuya
distinción radica tanto en sus mecanismos de inducción y mantenimiento,
como en sus consecuencias funcionales y caracterización molecula.El proceso
de inducción de anergia se caracteriza por un desequilibrio entre la
expresión del factor de transcripción NF-AT1 y otros factores tales como
AP-1, se asocia a la activación de un programa genético particular que
codifica para proteínas que funcionan como reguladores negativos de la
señalización a través del receptor de células T (TCR), mediante
defosforilación, proteolisis de moléculas de señalización o bloqueo de la
transcripción de citocinas efectoras.Así, se ha demostrado que la inducción y
el mantenimiento de anergia se asocia a disminución en vías de señalización
ulteriores al TCR, tales como aquellas asociadas a Vav 1 y PKC-? (proteína
kinasa C). Asimismo, recientemente se ha destacado el papel de ligasas de
ubicuitina (E3), tales como Cbl-b (Casitas B lymphoma), GRAIL (Gene
Related to Anergy in Lymphocytes) e Itch, cuyos genes forman parte del
programa inducido por calcio/calcineurina.
Pregunta de Investigación
¿Cuáles son los defectos en la expresión y/o funcionalidad de Cbl-b que
confieren un fenotipo de resistencia a anergia a las células T de pacientes
con LES?
Hipótesis:Existe disminución en la expresión del transcrito del gen y/ o en la
funcionalidad de Cbl-b, en comparación con células T de sujetos normales, lo
que confiere un fenotipo de resistencia a anergia a las células T de pacientes
con LES.
Objetivos Generales:Evaluar la expresión y funcionalidad de la ligasa de
ubicuitina asociada a anergia, Cbl-b, en células T de pacientes con LEG en
diferentes estados funcionales.

Pacientes y Metodo

a) Diseño del Estudio: Estudio comparativo, de tipo cuasi-experimental.
b) Pacientes y Controles. Se reclutaron a 16 pacientes mayores de 18 años,
con LES diagnosticado en base a los criterios de clasificación del Colegio
Americano de Reumatología provenientes del servicio de consulta externa de
reumatología del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador
Zubirán. Se obtuvo información clínica relevante a partir de su expediente.
Se registró la actividad de su enfermedad el día de la toma de la muestra de
acuerdo al índice MEX-SLEDAI y SLEDAI.
Criterios de Inclusión
Pacientes: Pacientes de 18 a 45 años de edad con diagnóstico de LEG según
los criterios del Colegio Americano de Reumatología, que se encuentren en
remisión (SLEDAI =0, MEX-SLEDAI=0) ó activos (MEX-SLEDAI > 5).
?Sin antecedente de tratamiento con corticoesteroides e inmunosupresores
en los 12 meses (remisión) ó 4 semanas (activos) previas a la toma de
muestra.
Controles:
?Individuos sanos de 18 a 45 años de edad.
?Sin antecedentes heredo familiares de LEG.
Criterios de Exclusión
?Diagnóstico de intolerancia a carbohidratos o Diabetes Mellitus.
Criterios de Eliminación
?Muestra insuficiente (número total de células T CD4+).
La participación de los pacientes y controles fue voluntaria; cada individuo
firmó una hoja de consentimiento informado.
c) Cálculo del tamaño de la muestra
Se realizó tomando en cuenta la proporción estimada (intensidad relativa) de
detección de las proteínas (ligasas de ubicuitina) relacionadas a anergia. Al
momento actual desconocemos la media, desviación estándar para el
transcrito del gen de Cbl-b.

Resultados

Se han reclutado en total 32 sujetos, 16 pacientes con LES en remisión y 16
controles, ajustados por edad y género. Se realizó el análisis de proliferación
y marcadores de activación mediante citometría de flujo con CFSE y
CD4-FITC + CD69-PE o CD40L-PE respectivamente.
Las células T de los pacientes con LES mostraron un índice de proliferación
menor ante condiciones de activación en comparación con los controles. Así
mismo, el índice de anergia (IpE-IpIo) fue menor en células T de pacientes
con LES vs controles.En términos de marcadores de activación, se
documentó un mayor porcentaje de células positivas para CD69 en pacientes
vs controles ante el protocolo de inducción de anergia. Sin embargo en
términos de la expresión de CD40L no se documentaron diferencias al
comparar los estados de activación y anergia en pacientes vs controles.La
expresión normalizada de Cbl-b fue menor en células T bajo inducción de
anergia en comparación con aquellas células en reposo (0.3396 vs 1.1149;
p=0.015] o ex vivo [0.3396 vs 1.0425; p=0.023).

Conclusiones

1. Las células T CD4+ de los pacientes con LES muestran un fenotipo de
resistencia a anergia ante la estimulación con ionomicina e incremento
aberrante en la expresión de superficie de algunos marcadores de activación,
tales como CD69.
2. Se documentó disminución en la expresión del transcrito del gen de Cbl-b
en células T CD4+ provenientes de pacientes con LES en remisión ante un
estímulo anergizante con ionomicina, lo cual puede asociarse al fenotipo de
resistencia a la inducción de la misma.
3. Los hallazgos reportados sugieren que las células T de los pacientes con
LES muestran un defecto intrínseco en algunos de los productos del
programa genético inducido por anergia, lo cual puede conferir a estas
células un fenotipo de resistencia a anergia a pesar de que muestran
características propias de células anérgicas, tales como una señalización
incrementada de calcio. Lo anterior podría explicar la persistencia de
activación en condiciones inapropiadas, como la falta de coestimulación, lo
cual puede participar en la inducción y mantenimiento de patología
autoinmune, como el lupus eritematoso sistémico.